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動物用透明化試薬 CUBIC
理化学研究所生命システム研究センター，ならびに東京大学大学院医学系研究科の上田泰己教授らによって開発された組織透明化技術「CUBIC」は，マウス全脳や全身の透明化により，1細胞解像度で細胞の働きを網羅的に解析できる技術です。弊社では，この組織透明化に使用するCUBIC試薬を提供しています。
※CUBIC試薬は理化学研究所のライセンスを受けて製品化したものです。
透明化には，CUBIC-L（製品コード：T3740）と，CUBIC-R+(N)（製品コード：T3983）あるいはCUBIC-R+(M)（製品コード：T3741）どちらか，の２製品が必要です。
サンプルや用途に合わせて，他のCUBIC試薬を組み合わせてご使用ください。
製品
- T3740
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-L [for delipidation and decoloring]
- T3983
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-R+(N) [for RI matching]
- T3741
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-R+(M) [for RI matching]
- T3780
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-B [for decalcification]
- T3781
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-HL [for highly fatty tissue and quenching autofluorescence]
- T3782
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-P [efficiently aids perfusion fixation]
- T3866
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-X1 [for tissue expansion]
- T3867
- Tissue-Clearing Reagent CUBIC-X2 [for RI matching while keeping the expanded size]
- M3294
- Mounting Solution (RI 1.520) [for CUBIC-R+]
- M3292
- Mounting Solution (RI 1.467) [for CUBIC-X2]
- C3709
- CUBIC-HV™1 3D nuclear staining kit
- C3708
- CUBIC-HV™1 3D immunostaining kit
- C3717
- CUBIC-HV™1 3D immunostaining kit (Casein separately)
※Mounting Solutionはどのような時に使うかをお知りになりたい場合は，Ｑ＆Ａへ
※CUBIC-HV™の詳細については，CUBIC-HV™のページをご覧ください。
特長
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【ベーシックプロトコール】2種類の試薬に浸すだけでマウス全身，動物各臓器の透明化が可能
CUBIC-L：脱脂・脱色用
CUBIC-R+(N)およびCUBIC-R+(M)：屈折率調整用
CUBIC-R+(N)（製品コード：T3983）とCUBIC-R+(M)（製品コード：T3741）の違いについて。
CUBIC-R+(N)は，CUBIC-R+(M)より廉価であることや，CUBIC-R+(M)より成分の結晶が析出しにくいことから，ハンドリングがしやすいものです。透明化サンプル中の蛍光シグナルが減衰することがありますが，浸漬後，数日程度は問題なく観察できます。
CUBIC-R+(M)は，蛍光シグナルの保持がより優れています。ただし，冬場などの低温時は，稀にサンプル内で成分の結晶が析出することがあります。その場合は37℃に数日置くと解消します。
そのため，まずCUBIC-R+(N)でお試し頂いた後，蛍光シグナルが観察できないようならばCUBIC-R+(M)の使用を推奨しております。 -
【オプショナルプロトコール】透明化処理の困難であった組織の透明化に適した試薬もご用意
CUBIC-B：骨を含む臓器用
CUBIC-HL：自家蛍光も低減させる，ヒトなどの高脂肪組織の脱脂用
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灌流固定と合わせて灌流させることで更なる透明化処理の効率化
CUBIC-P
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【拡張プロトコール】動物組織を肥大化させつつ透明化させることが可能
CUBIC-X1：組織肥大化用
CUBIC-X2：肥大化した組織のサイズを維持したまま屈折率調整用
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3次元サンプルの均一な染色のためのキットをご用意
CUBIC-HV™1 3D nuclear staining kit：核染色用キット
CUBIC-HV™1 3D immunostaining kit：免疫染色用キット
CUBIC-HV™1 3D immunostaining kit (Casein separately)：免疫染色用キット。バッファー中のカゼインが小分けにされているので長期保存に適応。
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蛍光タンパクの蛍光シグナルを保持（CUBIC-HLを除く）
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操作時間をより短縮
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光シート顕微鏡(LSFM)や共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)と組み合わせることにより，細胞解像度でのイメージングが可能
使用例：マウス全身透明化
図1. CUBICにより透明化したマウス全身（左），透明化とヨウ化プロピジウム(PI)による染色したマウス全身（右）
《マウス全身透明化の流れ》
＊染色工程は必要に応じて行ってください。
使用例：マウス臓器透明化
図2. CUBICにより透明化したマウス全脳（左），透明化と核染色・免疫組織染色したマウス全脳（右）
《マウス臓器透明化の流れ》
＊染色工程は必要に応じて行ってください。
使用例：生後6週以上の成体マウスのよりスムーズな透明化
《生後6週以上の成体マウスのよりスムーズな透明化の流れ》
＊染色工程は必要に応じて行ってください。
使用例：骨を含むマウスの体や臓器の透明化
《骨を含むマウスの体や臓器の透明化の流れ》
使用例：ヒトの脳の透明化
ヒトの脳の例
《ヒトの脳の透明化の流れ》
使用例：ヒト組織の強力な透明化
ヒトの脳の例
《ヒト組織の強力な透明化の流れ》
使用方法の動画
Ｑ＆Ａ
=======================>>[Q&Aをご覧になる場合はこちらをクリック]<<=======================
染色剤，抗体に関する質問
Q: 染色剤には何が使える？
A: 抗体を用いる場合は，直接蛍光ラベルされた抗体を0.5% Triton X™-100と0.01% NaN3を含むPBSで適切な濃度に希釈，核染色する場合はヨウ化プロピジウム等を用いることができます。ヨウ化プロピジウムは終濃度10µg/mLとなるように0.5M NaClを含む0.1M リン酸緩衝液(pH7.4)で希釈して用いてください。
Q: 研究室にある抗体を用いることは可能？
A: 参考文献中において，透明化前後で抗原性が保たれることを確認しているタンパクもありますが，全てのタンパクは確認していないため，実際にお持ちの抗体でご検討ください。
Q: 通常の免疫組織染色と同様に, 一次抗体の後に蛍光ラベル二次抗体を用いることは可能？
A: 二次抗体を用いたプロトコルに関する情報は持ち合わせておりません。一次抗体，二次抗体それぞれの浸透に時間を要するため染色に時間がかかるとお考え下さい。実際にお試しいただくか，一次抗体の蛍光ラベル化もご検討ください。
Q: どんな蛍光タンパクが使えるのか？
A: 弊社ではGFPを用いた蛍光シグナル保持試験をおこなっております。また参考文献中（Cell 2014, 157, 726.）ではEGFP，EYFP，mCherry，mKate2の蛍光シグナルの保持について報告されています。
Q: 免疫組織染色をして透明化する場合，どんな蛍光標識色素が使えるのか？
A: 参考文献中（Cell 2014, 159, 911.もしくはCell Reports, 2018, 24, 2196.）ではFITC，ローダミン，Alexa594，Alexa647といった蛍光標識色素が観察できることが確認されています。
透明化の操作に関する質問
Q: 透明化する際の容器は何を用いればいい？
A: マウス全身透明化には全身が入る程度の大きさのタッパーを，組織透明化には組織が若干膨らむことがあるため組織の直径よりやや大きいチューブ，容量30mL以上のチューブを推奨します。CUBICの試薬は水系のためポリプロピレンやポリエチレンの容器に入れても安全に利用できることを確認しております。
Q: 組織が膨らむことがあるとのことですが，実験に影響はない？
A: 各々の細胞が膨らむことはありますが，細胞の位置関係が保たれると報告されております。
Q: 動物から切除した臓器をすぐに透明化するのでサンプルは固定しなくてもよい？
A: 固定していないサンプルを透明化すると細胞の位置関係が保たれない場合がありますので，必ず固定操作を行ってください。
Q: 切除，固定してからしばらく時間が経過したサンプルは透明化可能？
A: 固定液に数週間浸しておいたサンプルや，固定後-80℃で保管していたサンプルは透明化可能です。
Q: パラフィン包埋サンプルを切片化して透明化できる？
A: パラフィン包埋サンプルは熱による脱パラフィン処理の後に透明化が可能です。しかし，通常の免疫染色のようにサンプルを数µm厚に切るのはお控えください。透明化するとサンプルがもろくなり，数µm厚では処理ができなくなります。そのためカミソリ等で少なくとも1mm以上の厚さで切り，透明化処理をおこなってください。詳しい透明化方法として参考文献（Sci. Rep. 2017, 7, 9269.）もご覧ください。
Q: 実際に透明化するにはどれくらいの試薬の量が必要？
A: マウス全身透明化の際には全身が浸る程度の量，各臓器透明化にはチューブを横にして臓器の半分がほぼ浸る程度の量を用いてください。用いるサンプルや容器の大きさにもよりますが，一例として一匹の成体マウス全身透明化にはCUBIC-Lが200 ‒ 400mL，CUBIC-R+が100 ‒ 200mL程度，マウスの各臓器透明化（約1cm3）にはCUBIC-Lが20 ‒ 40mL，CUBIC-R+が10 ‒ 20mL程度が必要です。
Q: 透明化が進まないのですが？
A: 以下の理由が考えられます。以下の対処法をご検討ください。
a) 固定に用いたPFA溶液のpHが高い
pH が8を超えると過固定で臓器が黄色くなり透明化が進みにくくなるため，pHを7 ‒ 7.5にしてください。
またPFAのpHや処理時間で透明化度が変わるため，なるべく時間を均一にして固定することをおすすめします。
b) 脱脂が完了していない
脱脂の工程を延長するか，CUBIC-L の交換頻度をご検討ください。
1日ごとにCUBIC-Lを新鮮なものにして 37℃で振とうさせることを推奨しております。
c) 透明化が完了していない
CUBIC-R+を新鮮なものにして透明化にかける時間を延ばしてください。
Q: 脱脂に要する時間は？
A: 成体マウスの心臓，肺，腸，すい臓，脾臓は3日程度であり，脳，肝臓，腎臓なら5日程度です。
透明化後に関する質問
Q: 観察にMounting Solution (製品コード：M3294およびM3292) は必要？
A: 一時的であれば，Mounting SolutionなしでCUBIC-R+やCUBIC-X2にサンプルや対物レンズを浸して観察することが可能です。しかしながら，画像取得のために長時間（1時間以上など）続けて観察する場合，CUBIC試薬には水が含まれており観察中に蒸発します。蒸発すると屈折率が変わって画像取得が困難になる場合があり，また蒸発が進むとCUBIC試薬が結晶化する場合もあります。そのため長時間の観察には，水分が含まれていないMounting Solutionのご使用を推奨します。
Q: 実験後の廃液はどうすればいい？
A: 所属機関の廃棄物担当者とご相談の上，所定の処理方法に則って廃液処理をおこなってください。なお基本的には，実験後の生体サンプルとそれを浸すのに用いた試薬は医療用廃棄物，感染性廃棄物として処理し，未使用のCUBIC試薬は水を多く含む有機廃液，難燃性廃液となります。
Q: 透明化後のサンプルの保存方法は？
A: 使用したCUBIC-R+やCUBIC-X2に漬けて常温保存可能です。なおCUBIC-R+やCUBIC-X2の溶媒である水が蒸発するとサンプルが固化する可能性があるため，パラフィルム等を用いて容器を密閉して保存してください。また, アガロースゲル中でも常温保存可能です。
＜アガロースゲル保存法＞
適当なチューブに，透明化に使用した CUBIC-R+に2%のアガロース粉末を加えたのち加熱し，溶解させます。アガロース溶液が冷えて固まる前に透明化サンプルを中に入れ，十分に冷やしてアガロースゲルを固めます。このまま常温で保存可能です。またチューブの先端を切り取り（右写真）切り取った先端から押し出すことでアガロースゲルのみの状態にすることも可能ですが，ゲルが表面から乾いて白っぽくなるため観察にはチューブ から押し出した直後をおすすめします。刃物をご使用の際には怪我に十分ご注意ください。
Q: 透明化サンプルがうまく観察できない
A: 光シート顕微鏡 (LSFM) や共焦点レーザー顕微鏡 (CLSM) での観察を推奨しております。また透明化後のサンプルはゲル状になるため，薄く切り出すのが難しい場合もあります。観察の際には，サンプルを観察用封入剤 (RI = 1.520) [M3294]または観察用封入剤 (RI = 1.467) [M3292]に浸し，それらの屈折率に対応した対物レンズを用いてください。
Q: 試薬の屈折率はいくらか？
A: CUBIC-R+の屈折率は1.52で，CUBIC-X2の屈折率は1.467です。それらの屈折率に対応した対物レンズや油浸オイルを用いてください。屈折率を変えるためにCUBIC-R+やCUBIC-X2に水などの溶媒を混ぜることは避けてください。
Q: 論文にCUBIC-1およびCUBIC-2とあるが，CUBIC-LおよびCUBIC-R+と同じものか？
A: CUBIC-1およびCUBIC-2と，CUBIC-LおよびCUBIC-R+は異なります。CUBIC-1およびCUBIC-2は第一世代のCUBICで，これを改良した第二世代CUBICがCUBIC-LおよびCUBIC-R+となり透明度が向上しています。役割として，CUBIC-1はCUBIC-Lと同じ脱脂・脱色作用を示し，CUBIC-2はCUBIC-R+と同じ屈折率調整作用を示します。なおCUBIC-R+(N)とCUBIC-R+(M)も異なったものであり，CUBIC-R+(N)は組成にnicotinamideを，CUBIC-R+(M)は組成にN-methylnicotinamideを用いております。CUBIC-R+(M)はCUBIC-R+(N)より蛍光シグナルの保持に優れており，弊社での蛍光シグナル保持試験に合格しております。しかしながら，CUBIC-R+(N)も実用的には蛍光シグナルの保持がなされます。
＊いずれの情報も透明化するサンプルやご使用になる染色剤や機器などにより透明化や染色結果が異なります。
適宜処理時間や染色剤濃度をご検討ください。
製品パンフレット（プロトコールも掲載）
参考文献
CUBIC-L, CUBIC-R+, CUBIC-B, CUBIC-HL, CUBIC-Pを用いた，
マウス全身・脳・肺・肝臓・肢・腎臓の透明化，マーモセット脳の透明化，ヒト脳・腎臓・肝臓・肺の透明化例
（CUBICによる透明化後の免疫染色プロトコール）
- Chemical Landscape for Tissue Clearing based on Hydrophilic Reagents
マウス全身・脳・肺の透明化例
- Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution
マウス脳，マーモセット脳の透明化例
- Whole-Brain Imaging with Single-Cell Resolution Using Chemical Cocktails and Computational Analysis
CUBIC灌流による，
マウス全身・心臓・肺・腎臓・肝臓の透明化例
- Whole-Body Imaging with Single-Cell Resolution by Tissue Decolorization
CUBIC-X1, CUBIC-X2を用いた，
マウス脳の肥大化例
- A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing
CUBICのヒト病理組織診断への応用例
- CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis
CUBIC-HV™キットによる全臓器・全身スケールの3次元組織染色・観察
- Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues
![Mounting Solution (RI 1.467) [for CUBIC-X2]](/_ui/responsive/theme-tci/images/missing_product_srp.jpg "Mounting Solution (RI 1.467) [for CUBIC-X2]")
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