ケムステ記事ピックアップ — 比色法の化学（前編）

比色法を知っていますか？
試薬等を用いてサンプルを発色させ、その発色度合いから濃度等を測定する方法です。この比色法は食品化学、環境分析、生化学など多くの分野において大活躍している方法です。
このトピックでは比色法が具体的にどの分野で、どのように役にたっているのか、また、その方法と原理を簡単に紹介します。

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５分で理解！比色法

比色法は数ある測定方法の中でももっとも簡単な原理かもしれません（それだけに奥が深いのですが・・・）。でも、このサイトを御覧になっている方の中には知らない方もいるかもしれないので、基本原理を簡単に説明します。

例えば、測定したい化合物をＡとします。このＡに発色試薬を混ぜると化学反応が起こり、ＡはＢという化合物になります（図1）。

このＢに色がつくので、この濃さを数値化し、間接的にＡの濃度を測定するのです。もし、Ａの濃度と生成物Ｂの濃度が比例するならば検量線を引くことにより、Ｂの色の濃さからＡの濃度を決定することができます（図2）。

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細胞死を評価する。 ～MTT法～

培養細胞を用いた細胞毒性試験や細胞死の経路の解明は、人の疾病の治療法開発の手がかりとなるため、分子生物学者をはじめとする多くの学者によって研究されています。では、細胞が死ぬというのはどういうことなのでしょう？これは突き詰めていくと難しい問題なのですが、学術的な見地からは細胞死はトリパンブルー色素排除試験 (1)ＭＴＴ法等を用いた比色法 (2)アラマーブルーを用いた蛍光法による方法が認められています。

そこで今回は比色法の例として、MTT法(MTT assay)を紹介します。MTTとは分子式C₁₈H₁₆BrN₅Sで示されるテトラゾリウム塩の一種です。MTTは細胞内に取り込まれると細胞内のミトコンドリアという器官の中にある脱水素によってホルマザン(Formazan)に変化します。このホルマザンは青色の非水溶性結晶であり、生成後は沈殿します¹⁾。これをDMSOなどの有機溶媒で溶解させ、よく混ぜると均一の赤紫色の溶液となるので、この溶液の570 nmにおける吸光度を測定します。

MTT自身は水溶性で黄色の溶液ですが、図3のように脱水素酵素による反応によって、MTTとNADHの間に酸化還元反応が起こり、MTTがFormazanに還元され、NADHがNAD⁺に酸化されます。この脱水素酵素はミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素で、細胞の健康状態の指標となります。細胞が元気な場合は酵素活性が高いのでFormazanへの還元が起こるが、細胞が弱っている場合はそれがあまり起こらず、細胞が死んでいる場合はほとんど起こりません。この度合いが色の濃さに反映されます。つまり、酵素活性の度合いが色の濃さとなって表れているということです。また、健康な細胞においては細胞数とFormazanの青色色素の濃度との間に良好な検量線を引くことができる（図2でいうと横軸が細胞数、縦軸が赤紫色素の濃さ（吸光度として測定）となる）ので、細胞数計測にも利用されています。

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実験方法

せっかくなので実験方法を簡単に説明しましょう。詳しくは論文等に載っていますのでそちらをご参照下さい。^{2), 3)}

1. 培養細胞をマルチウェルプレート等に等量ずつ蒔く。
2. ＭＴＴは予めＰＢＳ（生理食塩水）に溶かしておく。
3. 試験をする時はコントロール群（通常の培養液のみ）と薬剤投与群（薬剤を含む培養液）を同時間、インキュベートする。
4. その後、各群を通常の培養液に交換し、2で作成したＭＴＴ溶液を加えて、3時間、インキュベートする。
5. 培養液を除去し、DMSOを入れて、沈殿したホルマザンをよく溶かして、均一な溶液にする。
6. 570 nmの吸光度を測定する。
7. 細胞生存率はコントロール郡を100％として、薬剤投与群のコントロールに対する割合で評価する。

実際にマルチウェルプレート上で試験をすると図4のようなイメージになります。

薬剤Ａが濃度依存的に細胞毒性を示していることがＭＴＴ法でわかります。学術論文等ではこれを評価し、統計学的に差があることも示します。

いかがでしたでしょうか。このトピックで紹介したテトラゾリウム塩の還元を用いる比色法は、細胞毒性の測定みならず、活性酸素の測定などにも用いられます（NBT（ニトロソブルーテトラゾリウム）を使います）。

後編では食品化学において用いられる比色法について紹介しようと思います。

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参考文献

• 1) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays
  • T. Mosmann, J. Immunol. Methods 1983, 65, 55.
• 2) Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca²⁺ homeostasis
  • C. Pereira, C. R. Oliveira, Neurosci. Res. 2000, 37, 227.
• 3) 同仁化学研究所（株）プロトコル集より
• 4) ＭＴＴの生物学的な反応機構: Mechanism of Cellular 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) Reduction
  • Y. Liu, D. A. Peterson, H. Kimura, D. Schubert, J. Neurochem. 1997, 69, 581.

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